ปฏิกิริยาปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์เพื่อขยายยีน

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลาไรเซชัน (PCR) เป็นเทคนิคทางพันธุกรรมโมเลกุลสำหรับทำสำเนาหลายยีนและเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการจัดลำดับยีนด้วย ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์

ทำงานอย่างไร?

สำเนายีนถูกสร้างขึ้นโดยใช้ตัวอย่างของดีเอ็นเอและเทคโนโลยีดีพอที่จะทำสำเนาหลายชุดจากสำเนาเดียวของยีนที่พบในตัวอย่าง การขยายตัวยีนของ PCR เพื่อสร้างสำเนานับล้านชุดช่วยในการตรวจจับและระบุลำดับยีนโดยใช้เทคนิคภาพตามขนาดและค่าใช้จ่าย (+ หรือ -) ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ

ภายใต้เงื่อนไขควบคุม DNA ส่วนเล็ก ๆ จะถูกสร้างขึ้นโดยเอนไซม์ที่เรียกว่าดีเอ็นเอโพลิเมอร์ที่เพิ่ม deoxynucleotides (dNTPs) ไปยังชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่เรียกว่า "แม่แบบ" แม้แต่ชิ้นส่วนเล็ก ๆ ของดีเอ็นเอที่เรียกว่าไพรเมอร์ถูกใช้เป็นจุดเริ่มต้นของพอลิเมอร์ Primers เป็นชิ้น DNA ที่มนุษย์สร้างขึ้น (oligomers) ขนาดเล็กโดยปกติจะมีความยาวระหว่าง 15 ถึง 30 nucleotides พวกเขาจะทำโดยรู้หรือเดาลำดับดีเอ็นเอสั้นที่ปลายสุดของยีนที่กำลังขยาย ระหว่าง PCR DNA ถูกเรียงลำดับจะถูกให้ความร้อนและเส้นคู่จะแยกออกจากกัน เมื่อเย็นลงไพรเมอร์จะผูกมัดกับเทมเพลต (เรียกว่าการหลอม) และสร้างสถานที่สำหรับโพลิเมอร์ที่จะเริ่มต้น

เทคนิค PCR

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) เกิดขึ้นได้จากการค้นพบ thermophiles และเอนไซม์ polymerase thermophilic (เอนไซม์ที่รักษาความสมบูรณ์ของโครงสร้างและการทำงานหลังจากที่ความร้อนที่อุณหภูมิสูง)

ขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับเทคนิค PCR มีดังต่อไปนี้:

สร้างส่วนผสมด้วยความเข้มข้นของดีเอ็นเอเทมเพลตเอนไซม์โพลิเมอร์ primers และ dNTPs ความสามารถในการให้ความร้อนผสมโดยไม่ทำให้กลายเป็นเอนไซม์ช่วยในการทำซ้ำของตัวอย่างเกลียวคู่ของตัวอย่างดีเอ็นเอที่อุณหภูมิอยู่ในช่วง 94 องศาเซลเซียส

ตัวอย่างจะเย็นตัวลงสู่ช่วงปานกลางมากขึ้นประมาณ 54 องศาซึ่งจะช่วยในการย้อมสี (primer) ของไพรเมอร์ให้เป็นแบบดีเอ็นเอแบบ single-stranded

• ในขั้นตอนที่สามของวัฏจักรตัวอย่างจะถูกให้ความร้อนถึง 72 องศาอุณหภูมิที่เหมาะสำหรับ Taq DNA Polymerase สำหรับการยืดตัว ในระหว่างการยืดตัวดีเอ็นเอโพลิเมอร์จะใช้ดีเอ็นเอเส้นเดียวของเดิมเป็นเทมเพลตเพื่อเพิ่ม dNTP ที่เสริมเข้าไปในปลายทั้ง 3 ของแต่ละ primer และสร้างส่วนของดีเอ็นเอแบบคู่ในบริเวณที่น่าสนใจของยีน

ไพรเมอร์ที่มีการหลอมรวมกับลำดับดีเอ็นเอที่ไม่ตรงตามที่กำหนดไว้จะไม่คงตัวที่ 72 องศาซึ่งจะ จำกัด การยืดตัวของยีนที่น่าสนใจ

• ขั้นตอนการทำให้เสื่อมสภาพการหลอมและการยืดตัวนี้เกิดซ้ำหลายครั้ง (30-40 ครั้ง) ซึ่งจะเป็นการเพิ่มจำนวนสำเนาของยีนที่ต้องการในส่วนผสมแม้ว่ากระบวนการนี้จะน่าเบื่อถ้าทำด้วยตัวเองตัวอย่างสามารถจัดเตรียมและบ่มในเครื่อง Thermocycler ที่สามารถตั้งโปรแกรมได้ซึ่งปัจจุบันเป็นที่รู้จักกันทั่วไปในห้องปฏิบัติการโมเลกุลส่วนใหญ่และสามารถทำปฏิกิริยา PCR ได้อย่างสมบูรณ์ภายใน 3-4 ชั่วโมง
• แต่ละขั้นตอน denaturing จะหยุดยั้งการยืดตัวของวงจรก่อนหน้านี้ซึ่งจะตัดทอนเส้นใย DNA ใหม่และทำให้ขนาดของยีนดังกล่าวมีขนาดประมาณ
• ระยะเวลาของรอบการยืดตัวสามารถทำได้นานหรือสั้นขึ้นอยู่กับขนาดของยีนที่น่าสนใจ แต่ในที่สุดก็ผ่านรอบซ้ำของ PCR ส่วนใหญ่ของแม่แบบจะถูก จำกัด ให้มีขนาดของยีนที่น่าสนใจเพียงอย่างเดียว เนื่องจากจะมีการสร้างขึ้นจากผลิตภัณฑ์ของทั้งสองไพรเมอร์

มีหลายปัจจัยที่ทำให้ PCR ประสบความสำเร็จได้ซึ่งสามารถจัดการเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้น วิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการทดสอบผลิตภัณฑ์พีซีอาร์คือการทำอิเล็กโตรโฟเรสซิสแบบ agarose gel ซึ่งใช้ในการแยกชิ้นส่วน DNA ตามขนาดและค่าใช้จ่าย ชิ้นส่วนจะถูกมองเห็นโดยใช้สีย้อมหรือไอโซโทปรังสี

The Evolution

ตั้งแต่การค้นพบ PCR พบว่าดีเอ็นเอโพลิเมอร์อื่นนอกเหนือจาก Taq เดิมได้ถูกค้นพบแล้ว บางส่วนมีคุณสมบัติ "proofreading" ที่ดีขึ้นหรือมีเสถียรภาพมากขึ้นที่อุณหภูมิสูงขึ้นซึ่งจะช่วยปรับปรุงความเฉพาะเจาะจงของ PCR และลดข้อผิดพลาดจากการแทรก dNTP ที่ไม่ถูกต้อง

รูปแบบต่างๆของ PCR ได้รับการออกแบบมาเพื่อการใช้งานที่เฉพาะเจาะจงและปัจจุบันใช้เป็นประจำในห้องปฏิบัติการทางพันธุกรรมโมเลกุล บางส่วนเป็น Real-Time PCR และ Reverse-Transcriptase PCR การค้นพบ PCR ยังนำไปสู่การพัฒนาลำดับเบสดีเอ็นเอและเทคนิคโมเลกุลอื่น ๆ