เทคนิคในการจัดลำดับ DNA

สาขาเทคโนโลยีชีวภาพเป็นหนึ่งในการเปลี่ยนแปลงอย่างต่อเนื่อง การเติบโตและการพัฒนาอย่างรวดเร็วของการค้นคว้าวิจัยที่ทันสมัยขึ้นอยู่กับนวัตกรรมและความคิดสร้างสรรค์ของนักวิทยาศาสตร์และความสามารถในการมองเห็นศักยภาพของเทคนิคโมเลกุลพื้นฐานและประยุกต์ใช้กับกระบวนการใหม่ ๆ การมาถึงของ PCR ได้เปิดประตูขึ้นมากมายในการวิจัยทางพันธุกรรมรวมถึงวิธีการวิเคราะห์ DNA และการจำแนกยีนต่างๆตามลำดับ DNA ของพวกเขา

ลำดับเบสของดีเอ็นเอยังขึ้นอยู่กับความสามารถของเราในการใช้อิเลคโตรโฟเรซิสเจลเพื่อแยกเส้นใยดีเอ็นเอที่มีขนาดแตกต่างกันโดยมีขนาดเพียงคู่เดียว

ลำดับดีเอ็นเอ

ในช่วงปลายทศวรรษ 1970 มีการคิดค้นเทคนิคดีเอ็นเอลำดับดีเอ็นเอสำหรับโมเลกุลดีเอ็นเออีกต่อไป นี่คือวิธีการ

Sanger (หรือ didexy) และวิธีการ Maxam-Gilbert (chemical cleavage) วิธีการของ Maxam-Gilbert อิงตามความแตกแยกเฉพาะของ nucleotide โดยใช้สารเคมีและใช้ดีที่สุดในการเรียงลำดับ oligonucleotides (สั้น nucleotide polymers มักมีขนาดเล็กกว่า 50 คู่เบส) วิธีการแซงเจอร์ใช้กันมากเพราะได้รับการพิสูจน์แล้วว่าใช้เทคนิคได้ง่ายขึ้นและด้วยการมาถึงของ PCR และระบบอัตโนมัติของเทคนิคนั้นสามารถนำไปประยุกต์ใช้กับดีเอ็นเอสายยาวรวมทั้งยีนทั้งหมดได้ด้วย เทคนิคนี้จะขึ้นอยู่กับการสิ้นสุดของโซ่ด้วย dideoxynucleotides ในระหว่างการยืดตัวของ PCR วิธีการแซงเจอร์ (Sanger Method)

ในวิธี Sanger จะใช้ดีเอ็นเอของเส้นใยที่นำมาวิเคราะห์เป็นตัวแบบและใช้ปฏิกิริยาดีเอ็นเอโพลิเมอร์ในปฏิกิริยา PCR เพื่อสร้างเส้นใยฟรีโดยใช้ไพรเมอร์

เตรียมสารผสมปฏิกิริยา PCR 4 ชนิดแต่ละชนิดมีเปอร์เซ็นต์ didexynucleoside triphosphate (ddNTP) บางส่วนเป็นหนึ่งในสี่ nucleotides (ATP, CTP, GTP หรือ TTP) การสังเคราะห์ดีเอ็นเอใหม่จะยังคงดำเนินอยู่ต่อไปจนกว่าจะมีการรวมตัวของอะนาล็อกเหล่านี้ลงไปในเวลานั้นเส้นจะถูกตัดก่อนกำหนด

ปฏิกิริยาของ PCR แต่ละตัวจะจบลงด้วยการผสมผสานของความยาวของเส้นใยดีเอ็นเอที่แตกต่างกันทั้งหมดที่ลงท้ายด้วย nucleotide ที่ถูกทำเครื่องหมายด้วย didexy สำหรับปฏิกิริยานั้น เจลอิเล็กโตรโฟเรซิสใช้แยกเส้นใยของปฏิกิริยาทั้งสี่ออกเป็นสี่เลนและกำหนดลำดับของแม่แบบเดิมตามความยาวของเส้นใยที่สิ้นสุดด้วยสิ่งที่เป็นนิวคลีโอไทด์

ในปฏิกิริยาแซงเจอร์อัตโนมัติใช้ไพรเมอร์ที่มีป้ายสี่สีแตกต่างกันเรืองแสงแท็ก ปฏิกิริยา PCR ในกรณีที่มี nucleotide didexy ต่างกันจะทำตามที่อธิบายข้างต้น อย่างไรก็ตามต่อจากนั้นสารผสมทั้ง 4 ชนิดจะรวมกันและใช้กับเลนเดียวของเจล สีของแต่ละส่วนถูกตรวจจับโดยใช้ลำแสงเลเซอร์และข้อมูลจะถูกเก็บรวบรวมโดยคอมพิวเตอร์ซึ่งจะสร้างโครมาโตแกรมที่แสดงยอดของแต่ละสีซึ่งสามารถกำหนดลำดับดีเอ็นเอเทมเพลตได้

โดยปกติแล้ววิธีการเรียงลำดับแบบอัตโนมัติจะใช้ได้เฉพาะกับลำดับขั้นสูงสุดที่มีความยาวประมาณ 700-800 คู่ฐานเท่านั้น อย่างไรก็ตามมันเป็นไปได้ที่จะได้ลำดับยีนที่มีขนาดใหญ่และในความเป็นจริงทั้งจีโนมโดยใช้วิธีการขั้นตอนที่ชาญฉลาดเช่น Primer Walking และ Shotgun sequencing

ใน

Primer Walking

ส่วนที่สามารถทำงานได้ของยีนขนาดใหญ่จะเรียงตามลำดับโดยใช้วิธีแซงเจอร์ primers ใหม่จะถูกสร้างขึ้นจากส่วนที่น่าเชื่อถือของลำดับและใช้เพื่อดำเนินการต่อลำดับส่วนของยีนที่อยู่นอกช่วงของปฏิกิริยาเดิม

การเรียงลำดับ Shotgun ทำให้เกิดการสุ่มตัดส่วนของดีเอ็นเอที่น่าสนใจลงในส่วนที่เหมาะสมกว่า (สามารถจัดการได้) เรียงลำดับแต่ละส่วนและจัดเรียงชิ้นส่วนตามลำดับซ้อนกัน เทคนิคนี้ทำได้ง่ายขึ้นโดยการประยุกต์ใช้ซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์เพื่อจัดเรียงซ้อนทับกัน