วิธีการฟอกโปรตีน>

ส่วนสำคัญของการวิจัยด้านเทคโนโลยีชีวภาพคือการใช้เทคนิควิศวกรรมโปรตีนในการออกแบบหรือปรับเปลี่ยนโปรตีนที่มีคุณสมบัติเหมาะสมสำหรับการใช้งานเฉพาะทางอุตสาหกรรม ในการทำเช่นนี้นักวิทยาศาสตร์จะต้องสามารถแยกแยะและทำให้บริสุทธิ์โปรตีนที่น่าสนใจเพื่อให้สามารถศึกษาความสอดคล้องเฉพาะของพื้นผิวปฏิกิริยากับแกนด์อื่น ๆ และกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงได้

ระดับความบริสุทธิ์ของโปรตีนขึ้นอยู่กับการใช้โปรตีน

สำหรับสารบางชนิดสารสกัดหยาบจะเพียงพอ อย่างไรก็ตามสำหรับการใช้งานอื่น ๆ เช่นในอาหารและยาจำเป็นต้องมีระดับความบริสุทธิ์สูง เพื่อให้บรรลุนี้หลายวิธีการทำให้บริสุทธิ์โปรตีนมักจะใช้ในชุดของขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์

ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนแต่ละครั้งมักทำให้เกิดการสูญเสียผลิตภัณฑ์บางอย่าง ดังนั้นกลยุทธ์การทำให้บริสุทธิ์โปรตีนที่เหมาะคือขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ที่สุดในขั้นตอนน้อยที่สุด การเลือกขั้นตอนที่จะใช้ขึ้นอยู่กับขนาดการสะสมความสามารถในการละลายและคุณสมบัติอื่น ๆ ของโปรตีนเป้าหมาย เทคนิคต่อไปนี้เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำให้เป็นโปรตีน cytosolic เดี่ยว การทำให้บริสุทธิ์ของเซลล์โปรตีน cytosolic มีความซับซ้อนมากขึ้นและโดยปกติจะต้องใช้วิธีการที่แตกต่างกัน

ขั้นตอนแรกในการฟอกโปรตีนภายในเซลล์ภายในเซลล์เป็นขั้นตอนแรกในการเตรียมสารสกัดดิบ

สารสกัดจะมีส่วนผสมที่ซับซ้อนของโปรตีนทั้งหมดจาก cytoplasm เซลล์และโมเลกุลเล็ก ๆ ที่มีส่วนประกอบและแฟคเตอร์อื่น ๆ เพิ่มเติม สารสกัดหยาบอาจใช้สำหรับการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีชีวภาพบางอย่าง แต่ถ้าความบริสุทธิ์เป็นปัญหาต้องปฏิบัติตามขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ต่อไป สารสกัดโปรตีนดิบถูกเตรียมโดยการกำจัดเศษซากเซลล์ที่เกิดจากการหลอมเซลล์ซึ่งสามารถทำได้โดยใช้สารเคมีและเอนไซม์ sonication หรือ French Press เศษซากจะถูกดึงออกโดยการหมุนเหวี่ยงและ supernatant จะได้รับการฟื้นฟู การเตรียมโปรตีนของโปรตีนนอกเซลล์สามารถทำได้โดยการถอดเซลล์ออกโดยการปั่นแยก สำหรับแอพพลิเคชันด้านเทคโนโลยีชีวภาพบางอย่างมีความต้องการ

เอนไซม์ทนความร้อน

: เอนไซม์ที่สามารถทนต่ออุณหภูมิสูงโดยไม่ทำให้เกิดการเสื่อมสภาพได้ สิ่งมีชีวิตที่ก่อให้เกิดพวกมันมักเรียกว่า extremophiles วิธีที่ง่ายในการทำให้บริสุทธิ์โปรตีนที่ทนต่อความร้อนคือการทำให้โปรตีนอื่น ๆ ที่เป็นส่วนผสมในตัวทำละลายโดยการให้ความร้อนแล้วระบายความร้อนให้กับสารละลาย (ทำให้เอนไซม์สามารถปรับเปลี่ยนหรือ redissolve ถ้าจำเป็นโปรตีนที่ถูกทำให้เสียรูปสามารถถูกแยกออกได้โดยการหมุนเหวี่ยง

ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นกลาง

ในอดีตขั้นตอนที่สองร่วมกันในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์จากสารสกัดหยาบเป็นค่าความตกตะกอน ในโซลูชันที่มีความสามารถในการออสโมซิติกสูง (i.อี เกลือโซลูชั่น) กรดนิวคลีอิกในสารสกัดหยาบสามารถกำจัดได้โดยการตกตะกอนมวลรวมที่เกิดขึ้นกับ streptomycin sulfate หรือ protamine sulfate การตกตะกอนของโปรตีนมักทำโดยใช้แอมโมเนียมซัลเฟตเป็นเกลือ โปรตีนที่แตกต่างกันจะตกตะกอนในความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ

แอมโมเนียมซัลเฟต

โดยทั่วไปโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงขึ้นจะตกตะกอนในความเข้มข้นต่ำของแอมโมเนียมซัลเฟต การตกตะกอนเกลือไม่ได้มักจะนำไปสู่โปรตีนบริสุทธิ์สูง แต่สามารถช่วยในการขจัดโปรตีนที่ไม่พึงประสงค์บางอย่างในส่วนผสมและมุ่งเน้นตัวอย่าง เกลือในสารละลายจะถูกกำจัดออกโดยการฟอกไตผ่านท่อเซลลูโลสที่มีรูพรุนกรองหรือเจลยกเว้นโครมาโทกราฟี โปรโตคอลเทคโนโลยีชีวภาพที่ทันสมัยมักใช้ประโยชน์จากชุดเครื่องมือที่มีจำหน่ายในท้องตลาดจำนวนมากซึ่งพร้อมให้บริการโซลูชั่นสำเร็จรูปสำหรับขั้นตอนมาตรฐาน การฟอกสีของโปรตีนมักใช้โดยใช้ตัวกรองและคอลัมน์การกรองเจลที่เตรียมไว้ สิ่งที่คุณต้องทำคือทำตามคำแนะนำและเพิ่มปริมาณที่ถูกต้องของการแก้ปัญหาที่เหมาะสมและรอระยะเวลาที่กำหนดในขณะที่เก็บ eluant (สิ่งที่ออกมาในส่วนอื่น ๆ ของคอลัมน์) ในหลอดทดสอบสด

สามารถใช้วิธีการตรวจทางโครมาโตกราฟีโดยใช้คอลัมน์ที่มีบัลลังก์หรืออุปกรณ์ HPLC อัตโนมัติ การแยกด้วย HPLC สามารถทำได้โดยการทำ reverse phase การแลกเปลี่ยนไอออนหรือการยกเว้นขนาดและตัวอย่างที่ตรวจพบโดยอาร์เรย์ไดโอดหรือเทคโนโลยีเลเซอร์ การสร้างโปรตีนและการประเมินการทำให้บริสุทธิ์ Reverse phase chromatography

(RPC) แยกโปรตีนออกตามความ hydrophobicities < เทคนิคนี้มีการคัดเลือกสูง แต่ต้องใช้ตัวทำละลายอินทรีย์ โปรตีนบางตัวถูกทำละลายโดยตัวทำละลายอย่างถาวรและจะสูญเสียสมรรถนะในระหว่างกระบวนการ RPC ดังนั้นจึงไม่แนะนำให้ใช้วิธีนี้สำหรับการใช้งานทั้งหมดโดยเฉพาะอย่างยิ่งถ้าจำเป็นเพื่อให้โปรตีนเป้าหมายเก็บกิจกรรม

Ion-exchange chromatography

• หมายถึงการแยกโปรตีนตามค่า

  คิด

  • คอลัมน์สามารถเตรียมการแลกเปลี่ยนไอออนไนซ์หรือแลกเปลี่ยนไอออนได้ คอลัมน์การแลกเปลี่ยนประจุลบ มีเฟสคงที่โดยมีประจุบวกซึ่งจะดูดซับโปรตีนที่มีประจุไฟฟ้าลบ คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออนไนซ์
  • เป็นเม็ดทรายที่มีประจุลบซึ่งดูดซับโปรตีนที่มีประจุบวก การกำจัดโปรตีนเป้าหมายโดยการเปลี่ยนค่าความเป็นกรด - ด่างในคอลัมน์ซึ่งจะส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงหรือการวางตัวเป็นกลางของกลุ่มที่มีประจุไฟฟ้าในแต่ละโปรตีน การแยกโครมาโตแกรมขนาด ( gel filtration ) จะแยกโปรตีนขนาดใหญ่ออกจากโปรตีนขนาดเล็กเนื่องจากโมเลกุลที่มีขนาดใหญ่เดินทางได้เร็วขึ้นผ่านโพลิเมอร์ที่ผ่านการเชื่อมโยงกันในคอลัมน์ chromatography โปรตีนขนาดใหญ่ไม่พอดีกับรูขุมขนของพอลิเมอร์ในขณะที่โปรตีนขนาดเล็กทำและใช้เวลานานกว่าในการเดินทางผ่านคอลัมน์โครมาโตกราฟีผ่านทางตรงที่น้อยลง Eluate ถูกเก็บรวบรวมเป็นชุดของหลอดแยกโปรตีนตามเวลาการเจือจาง การกรองด้วยเจลเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการมุ่งเน้นตัวอย่างโปรตีนเนื่องจากโปรตีนเป้าหมายถูกเก็บในปริมาณที่น้อยกว่าการเติมลงในคอลัมน์ก่อนเทคนิคการกรองแบบเดียวกันอาจใช้ในระหว่างการผลิตโปรตีนขนาดใหญ่เนื่องจากมีประสิทธิภาพด้านต้นทุน Affinity chromatography เป็นเทคนิคที่มีประโยชน์มากสำหรับ "polishing" หรือทำให้กระบวนการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนสมบูรณ์ ลูกปัดในคอลัมน์โครมาโทกราฟีมีการเชื่อมโยงข้ามกับแกนด์ที่ผูกเฉพาะกับโปรตีนเป้าหมาย โปรตีนจะถูกลบออกจากคอลัมน์ด้วยการล้างด้วยสารละลายที่มีลิแกนด์ฟรี วิธีนี้ทำให้ได้ผลที่บริสุทธิ์และมีความเฉพาะเจาะจงมากที่สุดเมื่อเทียบกับเทคนิคอื่น ๆ SDS-PAGE คือการใช้ไฟฟ้าอิออน polyacrylamide ซึ่งทำในที่ที่มี SDS (sodium dodecyl sulfate) ซึ่งเชื่อมโยงกับโปรตีนทำให้มีประจุลบสุทธิมาก เนื่องจากข้อกล่าวหาของโปรตีนทั้งหมดมีความเท่าเทียมกันวิธีนี้จึงแยกแยะความแตกต่างของขนาดเกือบทั้งหมดขึ้นอยู่กับขนาด SDS-PAGE มักใช้เพื่อทดสอบความบริสุทธิ์ของโปรตีนหลังจากแต่ละขั้นตอนเป็นชุด เมื่อโปรตีนที่ไม่ต้องการออกจากส่วนผสมจะมีจำนวนแถบที่เห็นบนเจล SDS-PAGE ลดลงจนกว่าจะมีเพียงแถบเดียวแทนโปรตีนที่ต้องการ
  • Immunoblotting เป็นเทคนิคการสร้างภาพโปรตีนที่ใช้ร่วมกับ chromatography เกี่ยวกับความสัมพันธ์ แอนติบอดีสำหรับโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงใช้เป็นแกนด์ในคอลัมน์โครมาโตกราฟฟีความสัมพันธ์ โปรตีนเป้าหมายเก็บรักษาไว้ในคอลัมน์จากนั้นล้างออกด้วยการล้างคอลัมน์ด้วยสารละลายเกลือหรือสารอื่น ๆ แอนติบอดีที่เชื่อมโยงกับฉลากกัมมันตภาพรังสีหรือย้อมติดจะช่วยในการตรวจหาโปรตีนเป้าหมายเมื่อแยกออกจากส่วนอื่น ๆ ของส่วนผสม ที่มา:
  • Zubay G. 1988. ชีวเคมีฉบับที่ 2 แมคมิลแลนพับลิชชิ่งนิวยอร์กนิวยอร์กสหรัฐอเมริกา Amersham Pharmacia Biotech 1999. Protein Purification Handbook, AB ฉบับที่ Amersham Pharmacia Biotech Inc. มลรัฐนิวเจอร์ซีย์สหรัฐอเมริกา // www. Biochem uiowa edu / Donelson / ฐานข้อมูล% 20items / protein_purification_handbook รูปแบบไฟล์ PDF